1.  方法驗(yàn)證

分析方法驗(yàn)證是證明分析程序適合其預(yù)期目的的過程⁵。并非所有驗(yàn)證特征都適用于粒度分析。較早的 FDA 工業(yè)指南（非實(shí)施）草案文7包括一個(gè)專門針對(duì)粒度分析的部分。盡管較新的已發(fā)布文件取代了較舊的指南草案，但有關(guān)粒度分析的較舊部分提供了有關(guān)粒度分析與其他技術(shù)（如 HPLC）的不同之處的見解。舊文檔中的以下聲明有助于方法驗(yàn)證工作：

“方法驗(yàn)證通常涉及中間精度和重復(fù)性的評(píng)估。應(yīng)保證生成的數(shù)據(jù)是可重復(fù)的，并控制產(chǎn)品的質(zhì)量。"⁷

考慮到這一評(píng)論，下面提供了解決 DLS 方法驗(yàn)證的建議：

● 特異性：N/A，DLS 檢測大小變化但對(duì)不同化學(xué)物質(zhì)不敏感。

● 線性：N/A，DLS 沒有任何線性關(guān)系。

● 準(zhǔn)確性：N/A，儀器的準(zhǔn)確性使用標(biāo)準(zhǔn)粒子進(jìn)行驗(yàn)證，但常規(guī)定量裁判方法（SEM/TEM 顯微鏡）不包括準(zhǔn)確性確定。包括樣品的 SEM/TEM 圖像以支持方法驗(yàn)證可能是更合適的。

● 精密度（重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性）：這是需要重點(diǎn)關(guān)注的地方。通常這些術(shù)語的定義在粒度分析領(lǐng)域可能不同于其他技術(shù)。以下評(píng)論來自粒度分析領(lǐng)域：

    重復(fù)性：多次測量樣品。

    重現(xiàn)性：準(zhǔn)備樣品、測量、丟棄、清潔、重復(fù)。建議的方法是制備五份樣品，然后對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行五次分析。

    中間精密度：此活動(dòng)涉及第二位分析員、第二臺(tái)儀器或兩者兼而有之。如果所有測試都在一個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行，則由同一系統(tǒng)上的不同操作員在不同日期分析同一批次的樣品。如果要在多個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行測試，則同一樣本（或批次）由不同操作員在不同地點(diǎn)的不同系統(tǒng)上進(jìn)行分析。

● 范圍：N/A，僅在所用系統(tǒng)的工作范圍內(nèi)工作。無需對(duì)此進(jìn)行測試或記錄。

● 定量限：N/A，這只是測試粒徑。

● 檢測限：N/A，方法開發(fā)應(yīng)確保樣品在系統(tǒng)檢測限內(nèi)。

2.  結(jié)構(gòu)示例

兩名操作員在兩個(gè) Nicomp DLS 系統(tǒng)上分析了一種藥物物質(zhì)（異丙酚乳劑）。該樣品已過期，但仍顯示符合 USP<729>的合格結(jié)果。儀器設(shè)置如下：

Instrument A：

Instrument B：

3.  方法開發(fā)

首先分析 92 nm PSL 標(biāo)準(zhǔn)以確保適當(dāng)?shù)南到y(tǒng)性能。測量結(jié)果在預(yù)期值的 98% 以內(nèi)。建議在開始此類工作之前進(jìn)行此驗(yàn)證測試。

接下來進(jìn)行快速研究以測試濃度（稀釋）的影響。參見圖 1 中的結(jié)果。

遵循這些指南的內(nèi)容，DLS 規(guī)格（根據(jù)定義尺寸小于 10 µm）對(duì)于強(qiáng)度平均值可以是可重復(fù)的 ±20%，對(duì)于 PI 或其他計(jì)算結(jié)果指示分布寬度是可重復(fù)的 ±30%。對(duì)于某些藥品，這可能是一個(gè)可以接受的范圍，但要注意當(dāng)粒徑非常小時(shí)出現(xiàn)的統(tǒng)計(jì)問題。如果平均粒徑為 500 nm，±20%，則范圍為 400 – 600 nm，這還不錯(cuò)。但對(duì)于平均粒徑為 10 nm 的蛋白質(zhì)，范圍則為 8-12 nm，這樣的粒徑跨度變得非常挑戰(zhàn)且難以接受。

將 10 滴樣品加入 15 mL 去離子水中并進(jìn)行分析。重復(fù)相同的制備。然后將這些樣品按 2:1 稀釋并進(jìn)行分析。樣品看起來太渾濁，結(jié)果發(fā)生變化，因此將下一滴添加到 15 mL DI 水中。樣品出現(xiàn)輕微混濁，這些結(jié)果是可以接受的。有時(shí)，稀鹽溶液是比純?nèi)ルx子水更好的稀釋劑。下一步是將一滴樣品加入 10 mL 過濾后的 10 mM KCl 溶液中。這些結(jié)果似乎更好，因此 10 mM KCl 溶液用于本研究中的所有其他測量。

在進(jìn)行稀釋研究時(shí)，分析時(shí)間也從3分鐘到10分鐘不等。三分鐘、五分鐘和十分鐘分析時(shí)間的時(shí)間曲線圖如圖2-4所示。紅色=光強(qiáng)粒徑平均值，藍(lán)色=體積粒徑平均值，藍(lán)色=數(shù)量粒徑平均值。

該方法選擇了5分鐘的分析時(shí)間。在五分鐘的分析時(shí)間完成之前，光強(qiáng)平均粒徑結(jié)果已經(jīng)穩(wěn)定下來。但直到大約9分鐘前，體積和數(shù)量加權(quán)平均結(jié)果仍在變化。這是也是在使用DLS時(shí)僅選擇光強(qiáng)粒徑結(jié)果的一個(gè)原因。這可能是方法開發(fā)中測試重復(fù)性很好的一個(gè)點(diǎn)。在這種情況下，也許下一個(gè)測試的分析時(shí)間是四分半、五分和五分半鐘。在這項(xiàng)研究中沒有執(zhí)行這一步驟，值得指出的是，整個(gè)方法開發(fā)和驗(yàn)證研究在不到8個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。更嚴(yán)格的最終發(fā)布測試方法開發(fā)和驗(yàn)證方法很可能需要至少幾天時(shí)間。

4.  樣品準(zhǔn)備

——在干凈的瓶子里裝滿10毫升過濾后的KCl溶液

——用針頭注射器取出0.5毫升異丙酚

——在瓶子里注入1滴異丙酚和10毫升KCl溶液

——手旋轉(zhuǎn)直到混合(10秒)

——用一次性移液管將400μL樣品移入圓形一次性玻璃樣品池

——將玻璃樣品池放入黑色Holder支架·在Nicomp上打開樣品蓋

——將樣品池和支架插入Nicomp系統(tǒng)，Holder支架背向Nicomp的左側(cè)

——關(guān)閉Nicomp上的樣品蓋

確保儀器設(shè)置與如下所示的值匹配：

——單擊綠色“G"圖標(biāo)開始測量

——打印并記錄平均直徑、標(biāo)準(zhǔn)偏差、PI 、D10、D50 和 D90

——將結(jié)果輸入 Excel 電子表格

——計(jì)算五項(xiàng)分析的平均值和變異系數(shù)

——比較兩個(gè)數(shù)據(jù)集

5.  結(jié)果

樣品在 A 和 B 系統(tǒng)上獨(dú)立制備和分析。每個(gè)樣品分析五次以檢查重復(fù)性。這兩個(gè)系統(tǒng)的示例結(jié)果如圖 5 和圖 6 所示。

整個(gè)結(jié)果以表格形式顯示在圖 7 和圖 8 中。五個(gè)結(jié)果的疊加如圖所示。

6.  結(jié)論

查看綜合結(jié)果可以得出以下幾點(diǎn)觀察結(jié)果：

——即使是相隔數(shù)年生產(chǎn)的兩個(gè)系統(tǒng)也會(huì)生成相似的數(shù)據(jù)

——兩個(gè)系統(tǒng)之間存在明顯的 3% 偏差

——PI計(jì)算可能不是用于定義寬度分布的最佳值

——如果使用PI，則30%的差值似乎是合適的

——D10、D50、D90 結(jié)果顯示出更好的重現(xiàn)性，可能更容易為制藥行業(yè)所接受

純粹基于該數(shù)據(jù)集，基于三個(gè)測量的該藥物產(chǎn)品的規(guī)格可能類似于：

——光強(qiáng)平均值 = 200 nm ±20%，COV = 小于 20%

——D10 = 140 nm ±30%，COV = 小于30%

——D90 = 284 nm ±30%，COV = 小于 30% 或

——PI = 0.09 ±30%

上述建議規(guī)格僅來自觀察到的重現(xiàn)性，可能對(duì)藥物安全性或有效性沒有任何影響。USP<729>中的實(shí)際是否通過標(biāo)準(zhǔn)的要求只是粒徑尺寸必須低于 500 nm 并且具有低x2值。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的另一種方法可能是關(guān)注影響有效性和/或安全性的粒徑大小。本技術(shù)說明收集的數(shù)據(jù)是讓您了解 DLS 技術(shù)對(duì)于簡單樣品的可重復(fù)性/重現(xiàn)性

7.  儀器介紹

參考資料

1 USP<729>, Globule Size Distribution in Lipid Injectable Emulsions

2 ISO 22412 Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS)

3 USP<429>, Light Diffraction Measurement of Particle Size

4 Entegris Technical Note, DLS Sample Preparation

5 Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics, July 2015

6 Entegris Technical Note, DLS System Verification

7 Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods Validation, Draft Guidance, July 2000. No longer available for download at FDA website.

8 Entegris Technical Note, DLS Data Interpretation